本发明公开了一种水产品中霍乱弧菌的LAMP 试剂盒,包括以下试剂组分:反应缓冲液、检测霍乱弧菌的特异性引物、Bst DNA聚合酶、霍乱弧菌DNA阳性模板和超纯水;所述检测霍乱弧菌的特异性引物包括一对内引物FIP和BIP以及一对外引物F3和B3。本发明具有特异性强,敏感性高,简便快速的特点,可用于基层实时、快速、准确的检测霍乱弧菌。
1.一种水产品中霍乱弧菌的LAMP试剂盒,其特征在于,包括以下试剂组分:反应缓冲液、检测霍乱弧菌的特异性引物、BstDNA聚合酶、霍乱弧菌DNA阳性模板和超纯水;所述检测霍乱弧菌的特异性引物包括一对内引物FIP和BIP以及一对外引物F3和B3;内引物FIP的序列为:5’-AACAAGCTTGTGTAGCCACGGCTACAAGATTTACAGCCCGCG-3’;内引物BIP的序列为:5’-GGTTTTACGCACCAACGGCAAAGCATCGAGCACAGTTTGT-3’;外引物F3的序列为:5’-TTCACAAGCAGCTTGTGAGA-3’;外引物B3的序列为:5’-CGCTTCACCAGTATAGCGAG-3’;所述反应缓冲液包含以下组分:pH8.8的Tris-HCl20mmol/L,氯化钾10mmol/L,硫酸镁8mmol/L,硫酸铵10mmol/L,甜菜碱0.8mol/L,dNTPs1.4mmol/L,吐温-200.1%。
2.根据权利要求1所述的LAMP试剂盒,其特征在于:所述LAMP试剂盒的试剂组分还包括荧光目视测试剂,所述荧光目视测试剂为钙黄绿素。
3.根据权利要求1所述的LAMP试剂盒,其特征在于:25μL的LAMP检测体系的具体配置为:反应缓冲液16μL,40pmol/μL的内引物FIP1μL,40pmol/μL的内引物BIP1μL,20pmol/μL的外引物F31μL,20pmol/μL的外引物B31μL,8U/μL的BstDNA聚合酶1μL,样品DNA或霍乱弧菌DNA阳性模板2μL,超纯水补足至25μL。
4.根据权利要求2所述的LAMP试剂盒,其特征在于:25μL的LAMP检测体系的具体配置为:反应缓冲液16μL,40pmol/μL的内引物FIP1μL,40pmol/μL的内引物BIP1μL,20pmol/μL的外引物F31μL,20pmol/μL的外引物B31μL,8U/μL的BstDNA聚合酶1μL,钙黄绿素1μL,样品DNA或霍乱弧菌DNA阳性模板2μL,超纯水补足至25μL。
5.一种检测水产品中霍乱弧菌的特异性引物,其特征在于,包括一对内引物FIP和BIP以及一对外引物F3和B3;内引物FIP的序列为:5’-AACAAGCTTGTGTAGCCACGGCTACAAGATTTACAGCCCGCG-3’;内引物BIP的序列为:5’-GGTTTTACGCACCAACGGCAAAGCATCGAGCACAGTTTGT-3’;外引物F3的序列为:5’-TTCACAAGCAGCTTGTGAGA-3’;外引物B3的序列为:5’-CGCTTCACCAGTATAGCGAG-3’。技术领域
本发明涉及水产品生物检测技术领域,特别涉及一种水产品中霍乱弧菌的LAMP试剂盒。
背景技术
霍乱是由霍乱弧菌(Vibriocholera,VC)引起的烈性肠道传病,该病起病急、传播快、涉及范围广,属国际检疫传染病,在我国被列为甲类传染病之一,是主要食源性致病微生物之一,时时威胁着人类并给人类带来危害。目前,该菌是多数进出口水产品必检的致病菌之一。目前检测食品中致病微生物的方法主要以传统方法(SN/T1022-2010)为主,即分离鉴定方法,该方法所需时间长,一般情况下需要5-7天,有时达到10-15天,不仅耗时长,也易发生漏检,很难满足快速鉴定的需要。近几年有检测霍乱弧菌的多种方法报道,如酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化、PCR方法等,然而传统PCR检测需要经过变性—退火—延伸,加上DNA提取整个过程大概需要2-4小时才能得出结果。这些方法在成本、灵敏度、操作方便性上存有缺陷,一定程度上限制了它们在生产中的实际应用。LAMP作为一种新的核酸扩增技术,较其它分子生物学检测方法而言具有实验条件低、灵敏度高和特异性强等优势,在微生物的检测中受到青睐并推广应用。目前应用于霍乱弧菌的有3个专利,如申请号为200910107466.0的中国发明专利申请公开《环介导等温扩增技术LAMP检测霍乱弧菌mdh基因及其检测试剂盒》(授权公告号CN101892293A)、申请号为200710030446.9的中国发明专利申请公开《霍乱弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒》(授权公告号:CN101153332B)、申请号为201310119610.9的中国发明专利申请公开《霍乱弧菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法》(授权公告号CN103160606A)。但所采用的LAMP方法检测需要1小时后加入染料才能判断结果或采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像,这存在开盖造成的气溶胶污染以及对反应缺乏实时监控等不足,不能对检测结果做出准确的判定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水产品中霍乱弧菌的LAMP试剂盒,具有特异性强,敏感性高,简便快速的特点,可用于基层实时、快速、准确的检测霍乱弧菌。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种水产品中霍乱弧菌的LAMP试剂盒,包括以下试剂组分:反应缓冲液、检测霍乱弧菌的特异性引物、BstDNA聚合酶、霍乱弧菌DNA阳性模板和超纯水;所述检测霍乱弧菌的特异性引物包括一对内引物FIP和BIP以及一对外引物F3和B3;内引物FIP的序列(SEQIDNo.1)为:5’-AACAAGCTTGTGTAGCCACGGCTACAAGATTTACAGCCCGCG-3’;内引物BIP的序列(SEQIDNo.2)为:5’-GGTTTTACGCACCAACGGCAAAGCATCGAGCACAGTTTGT-3’;外引物F3的序列(SEQIDNo.3)为:5’-TTCACAAGCAGCTTGTGAGA-3’;外引物B3的序列(SEQIDNo.4)为:5’-CGCTTCACCAGTATAGCGAG-3’。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术,并针对霍乱弧菌vcc基因序列设计了两对特异性引物(内引物FIP和BIP、外引物F3和B3),由此开发了检测霍乱弧菌的LAMP试剂盒。本发明的检测霍乱弧菌的特异性引物对于霍乱弧菌的检测特异性强,灵敏度高。本发明提供的LAMP试剂盒可利用LAMP实施浊度仪对霍乱弧菌LAMP反应引物、反应体系及反应进程进行实时、定量、全程密闭监控分析,实现了高效、特异性扩增霍乱弧菌的LAMP引物,建立了可视化的霍乱弧菌的LAMP方法,它只能从霍乱弧菌阳性样本中进行核酸的特异性扩增,不与其他常见的致病菌发生非特异性反应。应用本发明只需按建立的体系加样即可实时检测出霍乱弧菌,快速准确的获得检测结果,为简便、快速地检测霍乱弧菌带来便利。作为优选,所述LAMP试剂盒的试剂组分还包括荧光目视测试剂,所述荧光目视测试剂为钙黄绿素。LAMP试剂盒加入荧光目视测试剂可实现可视化检测。作为优选,25μL的LAMP检测体系的具体配置为:反应缓冲液16μL,40pmol/μL的内引物FIP1μL,40pmol/μL的内引物BIP1μL,20pmol/μL的外引物F31μL,20pmol/μL的外引物B31μL,8U/μL的BstDNA聚合酶1μL,样品DNA或霍乱弧菌DNA阳性模板2μL,超纯水补足至25μL。作为优选,25μL的LAMP检测体系的具体配置为:反应缓冲液16μL,40pmol/μL的内引物FIP1μL,40pmol/μL的内引物BIP1μL,20pmol/μL的外引物F31μL,20pmol/μL的外引物B31μL,8U/μL的BstDNA聚合酶1μL,钙黄绿素1μL,样品DNA或霍乱弧菌DNA阳性模板2μL,超纯水补足至25μL。检测样品时用样品DNA,阳性对照用霍乱弧菌DNA阳性模板。作为优选,所述反应缓冲液包含以下组分:pH8.8的Tris-HCl20mmol/L,氯化钾10mmol/L,硫酸镁8mmol/L,硫酸铵10mmol/L,甜菜碱0.8mol/L,dNTPs1.4mmol/L,吐温-200.1%。一种检测水产品中霍乱弧菌的特异性引物,包括一对内引物FIP和BIP以及一对外引物F3和B3;内引物FIP的序列(SEQIDNo.1)为:5’-AACAAGCTTGTGTAGCCACGGCTACAAGATTTACAGCCCGCG-3’;内引物BIP的序列(SEQIDNo.2)为:5’-GGTTTTACGCACCAACGGCAAAGCATCGAGCACAGTTTGT-3’;外引物F3的序列(SEQIDNo.3)为:5’-TTCACAAGCAGCTTGTGAGA-3’;外引物B3的序列(SEQIDNo.4)为:5’-CGCTTCACCAGTATAGCGAG-3’。本发明的有益效果是:1、特异性强:所检测的阴性对照菌株均无阳性结果出来,与PCR检测结果一致。2、灵敏度高:最低检测限为22cfu/mL。3、得出结果迅速:普通PCR整个过程在2-4小时左右才能得出结果,一般LAMP方法也要1小时,本发明只需30分钟到50分钟即可。4、可视化检测,不造成污染:用于观察的荧光染料为反应前加入,加入的商用染料钙黄绿素实现可视化检测,且在检测过程中无需开盖。5、可实时检测产物:利用实时浊度仪可实时分析LAMP反应的结果,达到实时监测判断产物的目的。
附图说明
图1是本发明LAMP试剂盒的特异性检测结果,其中图1a为柱状图、图1b为扩增曲线图。图1a横坐标1-8分别为:霍乱弧菌1、副溶血弧菌2、大肠埃希氏菌3、金黄色葡萄球菌4、创伤弧菌5、拟态弧菌6、溶藻弧菌7、河流弧菌8。图2是本发明LAMP试剂盒的敏感性检测结果,其中图2a为柱状图、图2b为扩增曲线图。图2a横坐标2-8分别为不同霍乱弧菌浓度:2.2×10⁵cfu/mL(柱2),2.2×10⁴cfu/mL(柱3),2.2×10³cfu/mL(柱4),2.2×10²cfu/mL(柱5),2.2×10¹cfu/mL(柱6),2.2×10⁰cfu/mL(柱7),2.2×10^-1cfu/mL(柱8)。图2b的5条S形扩增曲线从左到右对应图1a的柱2-柱6。图3是本发明LAMP试剂盒的荧光可视化检测结果,图中:左管为霍乱弧菌为模板,右管为阴性对照(或空白对照)。
具体实施方式
下面通过具体实施例,并结合附图,对本发明的技术方案作进一步的具体说明。本发明中,若非特指,所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法,如无特别说明,均为本领域的常规方法。1、霍乱弧菌(霍乱弧菌VBO,购自广东环凯微生物科技有限公司)。阴性对照菌均购自中国工业微生物菌种保藏中心:副溶血弧菌(ATCC17802)、大肠埃希氏菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、创伤弧菌(ATCC27562)、拟态弧菌(CICC10474)、溶藻弧菌(ATCC17749)、河流弧菌(ATCC33809)。2、主要试剂及仪器:营养肉汤购自北京陆桥技术有限责任公司;细菌基因组DNA抽提试剂盒购自invitrogen公司;实时浊度仪(LA-320C)为日本荣研化学产品。3、引物设计、合成:引物根据霍乱弧菌vcc基因序列(NCBI),利用PrimerExplorerV4软件(日本荣研株式会社)设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。内引物FIP的序列(SEQIDNo.1)为:5’-AACAAGCTTGTGTAGCCACGGCTACAAGATTTACAGCCCGCG-3’;内引物BIP的序列(SEQIDNo.2)为:5’-GGTTTTACGCACCAACGGCAAAGCATCGAGCACAGTTTGT-3’;外引物F3的序列(SEQIDNo.3)为:5’-TTCACAAGCAGCTTGTGAGA-3’;外引物B3的序列(SEQIDNo.4)为:5’-CGCTTCACCAGTATAGCGAG-3’。4、样品DNA的提取:样品处理:取水产品类样品25g与225mL碱性蛋白胨水(配制方法:蛋白胨20g,氯化钠20g,蒸馏水1000mL,混匀后调解pH值至8.6±0.2(25°C),121°C灭菌15min)用拍打器进行混匀,制成混合液后置36±1°C培养8-18h。得增菌液。DNA提取:取上述增菌液1mL,12000rpm离心3min,弃上清,所得沉淀按照细菌基因组DNA抽提试剂盒的说明书提取样品的基因组DNA获得样品DNA。5、实时检测:采用本发明的试剂盒组分配成LAMP检测体系,25μL的LAMP检测体系的具体配置为:反应缓冲液16μL,40pmol/μL的内引物FIP1μL,40pmol/μL的内BIP1μL,20pmol/μL的外引物F31μL,20pmol/μL的外引物B31μL,8U/μL的BstDNA聚合酶1μL,样品DNA2μL,超纯水补足至25μL。65°C扩增反应,LAMP反应在实时浊度仪(LA-320C,日本荣研公司)进行密闭全程监控,浊度仪实时监测扩增情况。6、试剂盒的特异性检测:采用步骤5的方法分别对霍乱弧菌,以及阴性对照:副溶血弧菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌进行检测,根据浊度变化观察结果,检验方法的特异性。如图1结果显示,在30min左右霍乱弧菌出现扩增,浊度明显上升(图1b),LAMP检测结果呈阳性;其余7株菌株均未出现扩增,LAMP检测结果呈阴性。霍乱弧菌(阳性组)出现了蓝色柱状扩增条带(图1a),而使模块由蓝色改变为红色,并且出现S型扩增曲线(图1b);阴性对照组未出现蓝色柱状扩增条带(图1a),模块仍旧显示为蓝色,未出现扩增曲线(图1b)。7、试剂盒的灵敏度检测:取1mL纯培养菌液(将霍乱弧菌接种至营养肉汤,36°C±1°C培养18-24h)10倍梯度稀释至10^-1,并进行细菌计数,原始菌液浓度为2.2×10⁷cfu/mL,按步骤4的方法提取霍乱弧菌基因组DNA,按步骤5的方法进行LAMP扩增,分析其灵敏度。结果显示(见图2),2.2×10⁵cfu/mL~2.2×10^-1cfu/mL梯度稀释的菌液扩增后出现浊度曲线,表明呈LAMP阳性;2.2cfu/mL、2.2×10^-1cfu/mL浓度级稀释菌液未出现扩增,呈LAMP阴性。上述结果表明最低检测限为22cfu/mL。8、荧光可视化检测:采用本发明的试剂盒组分配成LAMP检测体系,25μL的LAMP检测体系的具体配置为:反应缓冲液16μL,40pmol/μL的内引物FIP1μL,40pmol/μL的内引物BIP1μL,20pmol/μL的外引物F31μL,20pmol/μL的外引物B31μL,8U/μL的BstDNA聚合酶1μL,钙黄绿素1μL,霍乱弧菌DNA阳性模板2μL,超纯水补足至25μL。65°C下反应60min后,在紫外灯下观察颜色。图3左管为以霍乱弧菌为模板的反应情况,右管为阴性对照(或空白对照),左管(阳性组)出现了绿色荧光,右管(空白对照组或阴性对照组)仍为浅橙色荧光,表明本发明的试剂盒可以方便基层使用,加入样品后,用低廉的水浴锅操作,即可快速观察结果,且无需开盖,避免污染。9、水产品样品的实际检测:利用本发明的试剂盒检测海产品50份,包括贝类10份、虾类20份和鱼类20类(被检海产品样品按照行业标准SN/T1022-2010进行验证),50份产品中3份检出霍乱弧菌,检测结果与SN/T1022-2010培养方法检测结果一致。验证本发明试剂盒的可靠性和实用性。本发明的水产品中霍乱弧菌的LAMP试剂盒(实时检测),包括以下试剂组分:反应缓冲液、检测霍乱弧菌的特异性引物、BstDNA聚合酶、霍乱弧菌DNA阳性模板和超纯水;所述检测霍乱弧菌的特异性引物包括一对内引物FIP和BIP以及一对外引物F3和B3;内引物FIP的序列为:5’-AACAAGCTTGTGTAGCCACGGCTACAAGATTTACAGCCCGCG-3’;内引物BIP的序列为:5’-GGTTTTACGCACCAACGGCAAAGCATCGAGCACAGTTTGT-3’;外引物F3的序列为:5’-TTCACAAGCAGCTTGTGAGA-3’;外引物B3的序列为:5’-CGCTTCACCAGTATAGCGAG-3’。本发明的水产品中霍乱弧菌的LAMP试剂盒(荧光可视化检测),包括以下试剂组分:反应缓冲液、检测霍乱弧菌的特异性引物、BstDNA聚合酶、霍乱弧菌DNA阳性模板、超纯水和钙黄绿素;所述检测霍乱弧菌的特异性引物包括一对内引物FIP和BIP以及一对外引物F3和B3;内引物FIP的序列为:5’-AACAAGCTTGTGTAGCCACGGCTACAAGATTTACAGCCCGCG-3’;内引物BIP的序列为:5’-GGTTTTACGCACCAACGGCAAAGCATCGAGCACAGTTTGT-3’;外引物F3的序列为:5’-TTCACAAGCAGCTTGTGAGA-3’;外引物B3的序列为:5’-CGCTTCACCAGTATAGCGAG-3’。以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案,并非对本发明作任何形式上的限制,在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。序列表<110>舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心<120>一种水产品中霍乱弧菌的LAMP试剂盒<130>2014.06<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>1aacaagcttgtgtagccacggctacaagatttacagcccgcg42<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>2ggttttacgcaccaacggcaaagcatcgagcacagtttgt40<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ttcacaagcagcttgtgaga20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4cgcttcaccagtatagcgag20